30/09/2008

Estudos de toxicidade e segurança - Toxicidade in vivo - Estudos de Teratogênese em camundongos

Estudos e testes especiais

 

• Efeito da aplicação do imunomodulador  P-MAPA no desenvolvimento de germe dental de fetos, pós implante intra-ocular em hospedeiros

 

Modelo experimental

 

O desenvolvimento dental proporciona condições de estudo excelentes para análise de formação de estruturas cellares, pois em um único órgão estão combinados os fenômenos de organização espacial, simetria, aquisição de forma complexa e citodiferenciação órgão-específica.

 

Por estas razões, o estudo desta estrutura, na fase embrionária animal, se presta ao estudo do efeito teratogênicos de drogas in vitro e in vivo, principalmente quimioterápicos.

 

Uma vez que que os tecidos normais são atingidos proporcionalmente ao seu grau de proliferação e indiferenciação, a administração de antineoplásicos e outras drogas em animais experimentais prenhes pode levar a efeitos teratogênicos aos fetos em formação.

 

Estudos com a ciclofosfamida demonstraram a ocorrência de malformação de narizes, orelhas e dentes incisivos na prole, quando administradas a animais experimentais durante o periodo gestacional.

Em experimentação utilizando germes dentais de molares inferiores transplantados para a câmara anterior de hospedeiros adultos, a ciclofosfamida alterou a morfogênese, sendo este efeito diretamente proporcional à dose empregada e da idade do feto quando da obtenção das peças [ Matheus , 1985 ].

 

Outro agente quimioterápico de ampla utilização, o metotrexato, ocasiona um ainda maior efeito sobre o crescimento dentário de animais submetidos ao produto na fase embrionária, quando comparado à ciclofosfamida, neste modelo experimental.

 

Por essas razões, a utilização de quimioterápicos é praticamente inviabilizada no período gestacional, por serem substâncias de comprovada ação teratogênica ao feto.

 

P-MAPA tem mostrado ação antineoplásica em diversos modelos experimentais consagrados para câncer, sendo comprovadamente capaz de induzir regressão tumoral, aumento de sobrevida de animais experimentais, aumento da atividade NK celular, produção de inteferon-gama, modulação de citoquinas, o que o capacita como agente terapêutico em várias situações de interesse clínico.

 

Assim sendo, é relevante o estudo de seu potencial teratogênico em modelos animais, tendo em vista a possibilidade de sua utilização terapêutica em situações em que a utilização de quimioterápicos seja desaconselhada, devido ao potencial para causar malformação fetal.

 

O objeto deste ensaio foi estudar um possível efeito teratogênico do P-MAPA através da observação das estruturas microscópicas de dentes molares de fetos de camundongos, que tiveram seus germes implantados na câmara anterior ocular de hospedeiros adultos, que a seguir foram submetidos a dosagens muito superiores à dosagem preconizada como terapêutica.

 

O processo de desenvolvimento de germes dentais, nesta metodologia, é impedido ou significativamente alterado, no caso de drogas com propriedades teratogênicas.

 

Protocolo experimental

 

Foram utilizados germes dentais dos primeiros molares inferiores, retirados de fetos de camundongos com 14 e 17 dias de vida intra-uterina. Os germes foram assepticamente dissecados em solução de Tyrode, em capela de fluxo laminar.

 

A idade fetal foi confirmada pela identificação do plug vaginal (dia 0) e confirmada posteriormente pelos critérios morfológicos de Gruneberg.

 

Os germes transplantados estavam na fase de botão (14 dias de desenvolvimento intra-uterino) e campânula avançada ( 17 dias de desenvolvimento intra-uterino) quando predominam a proliferação celular e a histodiferenciação.

 

Os germes dentais foram mantidos em meio de cultura apropriados (meio essencial mínimo de Eagle) até que fossem todos dissecados e transplantados para a câmara anterior do olho de camundongos adultos, que para tanto foram anestesiados com hidrato de cloral a 10% ( 4 ml/kg/ peso/i.p.).

 

Os animais implantados foram divididos em 2 grupos : grupo tratado ( 6 animais) e grupo controle ( 6 animais).

 

O grupo tratado recebeu doses diárias de 30 mg/kg /peso de P-MAPA em suspensão de água destilada, por via intraperitoneal, o que representa uma dosagem muito além da dosagem preconizada como terapêutica.

 

O grupo controle recebeu apenas água destilada em volume equivalente ao administrado no grupo tratado.

 

O período aplicação do imunomodulador  P-MAPA foi de 8 e 10 dias, respectivamente para os animais que receberam germes retirados aos 14 ( fase de botão) e 17dias ( fase de campânula avançada).

 

Os hospedeiros foram sacrificados após a última dose, sendo os globos oculares removidos, fixados em solução de formol a 10% e descalcificados por 15 dias, segundo a técnica preconizada por Morse.

 

As peças descalcificadas foram incluídas em parafina para possibilitar a obtenção de cortes de 6 micrômetros de espessura, que a seguir foram submetidos a coloração de hematoxilina-eosina (H.E. e posteriormente submetidos a análises microscópicas.

 

Resultados

 

• Transplantes de germes de 14 dias

 

Os germes dentais dos animais tratados apresentavam-se com todos os seus elementos estruturais característicos, próprios do desenvolvimento na câmara anterior do olho ( (veja Figura 1 e Figura 2).

 

A polpa dental mostra-se como um tecido conjuntivo ricamente celularizado, com vasos sanguíneos no seu interior e revestido por uma camada de odontoblastos diferenciados, inclusive na regiões cervicais. Verificou-se a presença de uma pequena camada de dentina, recoberta por esmalte em algumas áreas.

 

No órgão do esmalte, os ameloblastos apresentam-se altos, com núcleo basal, exceto nas regiões carentes de esmalte e mostram diferentes graus de diferenciação, inclusive junto as áreas cervicais da coroa.

 

O retículo estrelado ocupa os espaços intercuspídicos e é constituído por células esparsas. Perifericamente, identifica-se o epitélio externo do órgão de esmalte.

 

Circundando o germe dental, situa-se o saco dental constituído por células e fibras dispostas paralelamente à sua superfície. Trabéculas ósseas estão presentes ao redor destas estruturas e formam um tecido ósseo razoavelmente compacto ( Fig.2).

 

Os animais do grupo controle apresentam características morfológicas nas estruturas descritas, que em nada divergem dos aspectos encontrados nos animais tratados (Fig.1)

 

• Transplante de germes de dias

 

A polpa dos germes dentais dos transplantes no grupo tratado apresenta-se como um tecido conjuntivo frouxo, vascularizado, com os odontoblastos todos diferenciados em praticamente toda a extensão da coroa. Uma típica camada de pré-dentina precede uma espessa camada de dentina que se adelgaça em direção cervical.

 

A camada de esmalte que também se adelgaça em direção cervical é espessa e recobre a superfície da coroa, exceto nas áreas carentes deste tecido. Os ameloblastos formam uma camada celular com espessura variável, mostrando-se com formas colunares e com núcleo basal.

 

O saco dental, pouco evidenciado ainda, pode ser visualizado como células e fibras dispostas paralelamente ao órgão dental.

 

Muito pouco tecido ósseo pode ser visto nas áreas circundantes ao órgão dental.

 

As mesmas características descritas acima, foram visualizadas nos germes dentais de 17 dias, transplantados para as câmaras anteriores oculares dos animais controles (veja Figura 3 e Figura 4)

 

Conclusões

 

• Os resultados obtidos com o uso desta metodologia comprovam que o imunomodulador  P-MAPA não apresenta potencial teratogênico, já que seu uso não interferiu de nenhuma forma no pleno desenvolvimento dos germes dentais implantados nos animais hospedeiros, apesar das altas dosagens utilizadas.

 

• Os dados obtidos neste experimento vêm reforçar os resultados obtidos nos experimentos de toxicidade sub-crônica e performance reprodutiva, realizado com ratas Wistar - SPF, indicando a ausência de efeitos teratogênicos do P-MAPA na descendência de animais matrizes tratados com o produto durante período gestacional , mesmo em altas concentrações.

 

• Estes resultados capacitam o produto como uma opção a ser considerada em situações onde a utilização de medicamentos com potencial teratogênico é inviável.