29/09/2008

Estudos de toxicidade e segurança - Reprodução e pós-natal toxicidade em ratos

• Reprodução e pós-natal toxicidade em ratos

 

Animais

 

Ratos wistar SPF (specific pathogen free) foram utilizados neste experimento

 

• Protocolo experimental

 

O mesmo protocolo para toxicidade subcrônica ( toxicidade de doses múltiplas -12 semanas) foi utilizado :

 

• Grupos de 10 machos e 10 fêmeas cada um, foram injetados por via subcutânea, por 90 dias com as seguintes dosagens:

 

 

• 1 mg/kg /dia x 90 dias (dose baixa -DB)

 
• 10 mg/kg/dia x 90 dias (dose média- DM)

 

 

• 100 mg/kg/dia x 90 dias ( dose alta- DA)

 

 

 

Aos 91º e 96º dias o cruzamento foi permitido dentro os animais pertencentes ao mesmo grupo.

 

No 97º dia , os machos foram submetidos à coleta de líquido espermático e a seguir sacrificados.

 

A fecundação de todas as fêmeas foi assegurada pela observação do aparecimento de compressa vaginal.

 

Durante os próximos 20 dias (período gestacional) e durante o período de lactação ( 32º dia após nascimento) as fêmeas continuaram submetidas a aplicação de P-MAPA, por via sub-cutânea, nas mesmas doses anteriores.

 

Após o primeiro dia de nascimento, os filhotes foram contados e marcados para futuras avaliações.

 

Ao final do período de lactação as fêmeas foram anestesiadas e submetidas a coleta de sangue ( 5 ml/animal) e urina.

 

•Parâmetros avaliados nos animais:

 

No dia de nascimento (1º dia) e após 12 dias ( 12 º dia), os seguintes parâmetros foram avaliados nos descendentes : perímetro torácico, distância interauricular, comprimento longitudinal, comprimento transversal , raios X corporal, peso corporal (evolução) e diâmetro ocular .

 

No 13º dia, 1/3 dos descendentes de cada grupo foi sacrificado e os seguintes órgãos foram medidos ou pesados : baço, rim, timo, coração e fígado.

 

Resultados

 

 

 

FÊMEAS MATRIZES

 

Evolução de peso corporal

 

Os mesmos resultados da experimentação envolvendo animais submetidos ao composto por 90 dias, foram obtidos.

 

Os animais fêmeas ganharam mais peso que os controles e testemunhas, em todos os grupos submetidos ao composto.

 

Excreção e consumo de água

 

Não foram notadas diferenças estatisticamente significantes em relação aos controles.

 

Parâmetros hematológicos

 

• Série vermelha - parâmetros associados

 

Na série vermelha observou-se a estabilidade dos níveis de hemoglobina e hematócrito em relação aos controles.

 

De um ponto de vista morfológico, os eritrócitos dos animais tratados com o P-MAPA mostraram-se macrocíticos e hipercrômicos, com claro aumento do número de eritrócitos jovens e esse efeito mostrou-se de modo dose dependente da administração de P-MAPA.

 

Não foram observadas alterações no tempo de coagulação, trombina e protrombina dos animais tratados com o P-MAPA em relação aos controles. 

 

Série branca

 

A administração de P-MAPA induziu um aumento dose-dependente dos leucócitos, em função do aumento de linfócitos e neutrófilos, não se notando alterações morfológicas nestes elementos, que denotasse qualquer anormalidade.

 

Os monócitos e neutrófilos não mostraram variação em nenhum grupo tratado com o P-MAPA em relação aos grupos controle.

 

Parâmetros bioquímicos

 

• Metabolismo ósseo

 

Foi observado um aumento dos níveis de Fósforo e uma diminuição moderada nos níveis de Cálcio, proporcional à dosagem de P-MAPA administrada, revelando influência do composto no metabolismo ósseo

 

Alterações de metabolismo ósseo são comuns em casos envolvendo disfunção da paratiróide, hipervitaminose-D e ainda é devida à administração de sais de magnésio, oxalatos, fosfatos e citratos.

 

A molécula de P-MAPA contém uma significativa proporção de Magnésio e isto pode explicar a alteração observada nos níveis séricos de P e Ca.

 

Tal alteração no metabolismo ósseo não foi julgada significativa para o desenvolvimento normal da prole e matrizes, uma vez que experimentos de toxicidade especial, envolvendo a observação da evolução e morfologia das raízes dentais e fechamento palatal de embriões de animais, submetidos a altas concentrações de P-MAPA, não mostraram nenhuma interferência no desenvolvimento intra-uterino destas estruturas.

 

Metabolismo energético

 

Não foram observadas alterações em relação aos grupos controle

 

Parâmetros bioquímicos

 

Em relação às matrizes, os parâmetros bioquímicos se comportaram de modo similar aos do experimento de toxidade subcrônica ( toxidade de doses múltiplas de 90 dias ou 12 semanas)

 

Performance reprodutiva -machos

 

Uma avaliação microscópica dos espermatozóides dos machos matrizes submetidos à aplicação de P-MAPA não mostrou diferenças morfológicas em relação aos animais controles .

 

Anatomopatologia ( animais matrizes)

 

Os exame anatomopatológicos dos órgãos e estruturas funcionais dos animais não revelou anormalidade dignas de nota nas matrizes, em relação aos animais controles As alterações observadas são devidas ao efeito imunomodulador do P-MAPA e são visualizadas em estruturas e órgãos considerados como alvo :

 

• Intestino grosso - Não foram observadas alterações patológicas no intestino grosso dos animais, mas as Placas de Peyer se apresentaram proeminentes e com a atividade linfóide associada ao intestino grosso (GALT) aumentada nos animais tratados com o P-MAPA.

 

• Linfonodos - Apresentaram-se dentro da normalidade nos exames anatomopatológicos, porém apresentando uma alta atividade nas zonas corticais e paracorticais, onde uma densa população pôde ser visualizada, com predominância de células reticulares e linfócitos B.

 

• Os cordões e seios medulares nos linfonodos dos animais tratados com o P-MAPA se mostram mais densos que os animais controles e testemunhas.

 

• O timo se apresentou inalterado nos animais tratados com o P-MAPA em relação aos controles.

 

• O tecido do baço dos animais tratados com dose alta (DA) de P-MAPA mostrou significativo aumento de células linfóides (B e T) ao redor da artéria penicilata e centros germinativos puderam ser visualizados com a presença de numerosas células do sistema reticuloendotelial (macrófagos) , quando comparado aos controles.

 

• Animais tratados com uma alta dose de P-MAPA mostram uma hiperfunção do sistema macrocítico-esplênico, associado à necrose de elementos linfóides e presença de numerosos megacariócitos.

 

• Estas alterações visualizadas nas estruturas citadas, não foram julgadas de natureza patológica, mostram-se proporcionais a dosagem de P-MAPA administrada e são devidas à ativação do sistema imunológico, ocasionada pelo produto.

 

DESCENDENTES

 

Número de indivíduos

 

Não foram notadas diferenças entre o número de filhotes das matrizes tratadas com o P-MAPA em relação aos controles.

 

Parâmetros de desenvolvimento externo

 

Perímetro torácico

 

Filhotes machos das matrizes tratadas com dose alta (DA) de P-MAPA e todos os filhotes fêmeas nas 3 dosagens utilizadas exibiram um declínio no perímetro torácico, de maneira estatisticamente significante aos 12 dias de nascimento, mas não às 24 horas de nascimento.

 

Comprimento longitudinal

 

Notou-se uma redução no comprimento longitudinal ( medido do focinho a ponta da cauda) na medição efetuada às 24 horas do nascimento, apenas nos filhotes cujas mães foram tratadas com altas doses de P-MAPA. Nas medições efetuadas com 12 dias após o nascimento todos os descendentes apresentaram menor tamanho longitudinal, proporcional à dose aplicada às matrizes.

 

Comprimento transversal

 

Os mesmos resultados dos apresentados para o comprimento longitudinal, foram obtidos em relação a este parâmetro.

 

Distância interauricular

 

Um decréscimo da distância interauricular foi observado apenas no primeiro dia de nascimento dos descendentes, para mães tratadas com dose média (DM) e dose alta (DA) de P-MAPA.

 

Entretanto, as medições efetuadas nos descendentes aos 12 dias pós-nascimento, não evidenciaram uma relação dose-dependente da administração de P-MAPA para este efeito.

 

Diâmetro ocular

 

Não foram observadas alterações nos descendentes no primeiro dia de nascimento para ambos os sexos e aos 12 dias nos descendentes fêmeas. Entretanto, aos 12 dias de nascimento, filhotes machos exibiram um decréscimo no diâmetro ocular de maneira dose-dependente.

 

Peso corporal

 

Todos os descendentes, machos e fêmea,s apresentaram uma redução de peso corporal de maneira dose dependente.

 

Todas as alterações nos parâmetros mencionados são decorrentes do fato de que os filhotes cujas mães foram tratadas com o P-MAPA apresentaram tamanhos menores que os filhotes das matrizes-controle.

Parâmetros de desenvolvimento interno

 

Peso de órgãos

 

Em geral, os descendentes machos e fêmeas de matrizes tratadas com P-MAPA exibiram órgãos com pesos menores que os filhotes de matrizes-controle.

 

Entretanto, esses valores, somente possuem relevância estatística no peso do fígado dos filhotes de matrizes tratadas com a 3 dosagens utilizadas e para coração, timo, baço e rins dos filhotes cujas mães foram tratadas com dose alta (DA) do composto.

 

Conclusões

 

• A análise dos parâmetros de desenvolvimento interno e externo dos descendentes revelou que nenhumas das alterações são de natureza patológica e ainda não podem ser claramente relacionadas ao uso de P-MAPA durante a gestação e lactação dos animais experimentais.

 

• O menor tamanho dos descendentes possivelmente está relacionado ao stress ocasionado pelo longo período ( total = 128 dias) de administração do composto nas matrizes.