28/09/2008

Estudos de toxicidade e segurança - estudos in vivo -toxicidade crônica

• Estudos toxicológicos de dose múltipla de 4 semanas ( 30 dias) em primatas

 

O Modelo biológico - Cebus apella.

 

A família Cebidae compreende cerca de 37 espécies de primatas do Novo Mundo e entre eles, o denominado macaco capuchinho (Cebus apella), também conhecido em algumas regiões do Brasil como macaco-prego.

 

Estes animais por sua sensibilidade a infecções também ocorrentes em seres humanos são muito utilizados como modelos biológicos para o estudo de enfermidades tropicais, tais como tuberculose e doença de Chagas.

 

Os macacos capuchinhos (Cebus apella) são também utilizados em experimentos envolvendo metabolismo, níveis sanguíneos de colesterol e triglicérides e finalmente são utilizados em experimentos envolvendo níveis dos elementos sanguíneos.

 

Por estas razões constituem-se em excelentes modelos biológicos para estudos de toxicidade envolvendo fármacos.

 

Animais e dosagens utilizadas

 

Macacos capuchinhos (Cebus apella) machos foram utilizados, divididos em 4 grupos :

 

Grupo Controle: Recebeu solução salina em mesmo volume da substância experimental

 

Grupo Dose Baixa: Recebeu 5mg/kg de P-MAPA via i.m. por dia x 30

 

Grupo Dose Média: - Recebeu 10 mg de P-MAPA via i.m. por dia x 30 dias

 

Grupo Dose Alta: Recebeu 30 mg de P-MAPA via i.m. por dia x 30 dias

 

Protocolo experimental (veja Figura 1)

 

Figura 1

 

O P-MAPA foi suspenso em solução salina ( NaCl 0,9%) e administrado diariamente aos animais por 30 dias, que para isso foram anestesiados com éter. O peso dos animais foi anotado diariamente e ajustes de dosagens efetuados de acordo com estas medições.

 

Os animais recebiam uma dieta protéico-calórica balanceada consistindo de frutas, vegetais e ovos, complementada com ração e com suprimento de água ilimitado.

 

Dos grupos de Dose Alta e Dose Média, um exemplar de cada grupo foi preservado para exames posteriores, para se avaliar a reversibilidade de eventuais mudanças hematológicas e bioquímicas.

 

No 31º dia de tratamento os animais foram anestesiados, pesados e 10 ml de sangue coletado para análises hematológicas (série eritrocitária, hematócrito, hemoglobina, e leucograma) e análises bioquímicas (glicose, triglicérides, colesterol, fósforo, cálcio, proteínas totais e frações, TGO, TGP, LDH e Gama-GT).

 

Os orgãos-alvo e outras estruturas foram dissecados dos animais para estudos histológicos.

 

Resultados

 

Parâmetros fisiológicos

 

Gráfico (parâmetros fisiológicos-ganho de peso) (veja Figura 2

 

Figura 2

 

Os animais tratados com a dose média de P-MAPA apresentaram o maior ganho de peso.

 

Parâmetros hematológicos

 

Gráfico (parâmetros hematológicos) (veja Figura 3)

 

Figura 3

A série eritrocitária não se mostrou significativamente alterada em nenhum dos grupos tratados com o P-MAPA. Também não ocorreu alteração no tempo de coagulação sangüínea frente aos animais controles e testemunhas.

 

O total de leucócitos aumentou nos animais tratados com o P-MAPA e este acréscimo se deu à custa do acréscimo de linfócitos e neutrófilos, principalmente.

 

Esse efeito ocorreu de modo dose-dependente.

 

Parâmetros bioquímicos

 

a) Gráfico (metabolismo energético) (veja Figura 4 

 

Figura 4

 

Pequenas alterações foram observadas nos níveis de glicose em todos os grupos tratados, mas dentro da faixa de valores considerados normais para a espécie, sem configurarem hipoglicemia.

 

Um largo decréscimo nos níveis de colesterol e triglicérides foi observado em todos os animais tratados, frente aos valores dos controles (veja Figura 4 acima)

 

b) Gráfico (metabolismo hepático) (veja Figura 5)

 

Figura 5

 

TGO: Aumentou significativamente quando comparado aos controles, no grupo de dose baixa, mas essa alteração foi menos pronunciada nos outros grupos.

 

TGP: Níveis levemente aumentados no grupo de dose baixa e diminuídos nos outros grupos

 

Gama-GT: Níveis mais altos que os níveis do grupo controle foram observados no grupo de Dose Baixa e Dose Média. O grupo de Dose Alta apresentou o maior incremento.

 

LDH: Todos os grupos tratados apresentaram um aumento dose-dependente quando comparado ao grupo controle.

 

c) Gráfico (metabolismo ósseo) (veja Figura 4)

 

Figura 4

 

Níveis de Cálcio levemente superiores aos controles foram observados somente no grupo de Dose Alta.

 

Os níveis de Fósforo mostraram-se mais elevados que os animais do Grupo Controle em todos os grupos tratados com P-MAPA.

 

Anatomopatologia - análises histológicas

 

Tecido muscular - local de aplicação

 

Devido a natureza insolúvel do composto, sinais indicativos de miosite focal foi observada no tecido do local de aplicação para os animais do grupo de dose alta. Não foram observados sinais de infecção. As observações histológicas indicam que o processo é reversível.

 

Sistema hematopoiético

 

As alterações celulares observados nas análises histológicas são indicativos da ativação dos órgãos-alvo e não se constituem em sinais de alterações .

 

Fígado

 

No grupo de Dose Alta apenas um dos animais exibiu 3 (três) focos hipercelulares ( ao redor de 20 células) constituído por macrófagos, monócitos e linfócitos, associados a processos degenerativos no centro lobular do órgão.

 

Neste mesmo grupo (Dose Alta) o tecido hepático mostrou hepatócitos com granulosa e com citoplasma hialino. Entretanto, foram notados hepatócitos nas veias lobulares centrais apresentando sinais de degeneração hidrópica.

 

No grupo de Dose Média, os tecidos hepáticos se apresentaram normais, apenas se notando leves alterações sugestivas de processos degenerativos focais.

 

No grupo de Dose Baixa, os tecidos hepáticos se mostraram absolutamente normais.

 

Estes achados e conclusões das análises histológicas corroboram os dados obtidos nas análises bioquímicas de sangue, principalmente no que se refere ao grupo de Dose Alta.

 

Apesar dos achados nos grupos de Dose Alta e Dose Média serem de natureza reversível e compatível com dano hepático limitado, os resultados sugerem a necessidade de monitoramento da função hepática nos casos de administração continuada do produto, principalmente em pacientes com histórico clinico e laboratorial de disfunção hepática.

 

Rins

 

No grupo de Dose Alta, os rins em termos de estruturas microscópicas se mostravam com aspecto normal. Apenas em um dos animais, notou-se um foco hipercelular constituído por linfócitos e plasmócitos na região cortical. Este achado está possivelmente associado a um processo muito limitado incapaz de comprometer a funcionalidade do órgão. Este mesmo animal mostrou uma leve nefrite intersticial focal, provavelmente sem importância clinica.

 

No grupo de Dose Média, apenas quatro focos hipercelulares foram vistos nos tecidos renais examinados. Esses focos eram formados por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, com distribuição intersticial, com atrofia de poucos glomérulos. O diagnóstico é sugestivo de nefrite interfocal, de natureza leve associado a atrofia de glomérulos. Não foram notadas evidências de disfunção no órgão.

 

No grupo de Dose Baixa, os tecidos renais se apresentavam com aspecto normal, com apenas um caso apresentando foco hipercelular discreto.

 

Apesar da conclusão de que as alterações nos tecidos representativos de estruturas renais, são de natureza discreta, e possivelmente reversível e não representativas de disfunção renal, esses achados sugerem a necessidade de monitoramento da função renal em pacientes em uso do P-MAPA, principalmente nos casos de uso prolongado e/ou ocorrência de disfunção renal.

 

Pulmões

 

Como os animais eram anestesiados diariamente com a utilização de éter, para administração de P-MAPA, realizaram exames histológicos dos tecidos pulmonares, para verificar a existência de algum tipo de dano, seja pela utilização do anestésico, ou ainda por alguma reação de caráter inflamatório, ocasionada por uso concomitante de um imunomodulador (P-MAPA).

 

Apenas um dos animais, pertencente ao grupo de Dose Alta exibiu material mineralizado em três pontos do tecido examinado, sem evidenciar, entretanto qualquer tipo de reação inflamatória associada.

 

Outro animal do mesmo grupo apresentou fragmentos de nematóides em alvéolos pulmonares.

 

Os tecidos pulmonares dos animais dos grupos de Dose Média e Dose Baixa mostraram-se totalmente normais.

 

De acordo com esses achados, não foram evidenciadas anormalidade nos tecidos pulmonares que pudessem ser associadas à utilização do imunomodulador P-MAPA.

 

 

Conclusões - parâmetros bioquímicos

 

• Em geral, algumas alterações foram observadas nas análises bioquímicas de sangue, porém de natureza reversível desde que os animais observados aos 30 e 60 dias após interrupção do tratamento apresentaram-se com níveis bioquímicos normais. 

 

Conclusões - parâmetros histológicos

 

• As análises histológicas realizadas nos tecidos hepáticos e renais mostraram alterações focais que não foram julgadas capazes de ocasionar manifestações clinicas relevantes e não apresentavam sinais de estarem em vias de transformar-se em processos crônicos.

 

Conclusões gerais do ensaio

 

• Nos estudos de toxicidade crônica em primatas, de acordo com todas as análises e parâmetros avaliados, o imunomodulador P-MAPA não revelou sinais de toxicidade relevante, mesmo quando utilizado em dosagens relativamente elevadas.

 

• É importante observar-se  que  em termos relativos, as dosagens utilizadas no experimento, principalmente as denominadas dose média e dose alta, referem-se à utilização de quantidades de produto que são centenas de vezes mais elevadas que as dosagens preconizadas como  terapêuticas.

 

• Mesmo nas dosagens mais elevadas utilizadas no ensaio, as alterações visualizadas nos exames bioquímicos e anatomopatológicos foram julgadas de caráter transitório e não foram consideradas como reveladoras de qualquer sinal de dano orgânico grave ou irreversível.