28/09/2008

Estudos de toxicidade e segurança - Estudos in vivo - toxicidade subcrônica

 • Toxicidade subcrônica (90 dias) ratos Wistar

 

Protocolo experimental

• Grupos de 10 machos (idade de 4 semanas, 100 g/peso corporal) e 10 fêmeas (idade de 4 semanas, 90-100 g/peso corporal) foram submetidos a aplicação de P-MAPA (suspensão de 10 ml /kg) por via subcutânea, durante 90 dias, nas seguintes dosagens :

 

• Grupo Dose Baixa ( DB ) = 1 mg/kg/dia x 90 dias

 

• .Grupo Dose Média ( DM ) = 10 mg/kg/dia x 90 dias

 

• Grupo Dose Alta ( DA ) = 100 mg/kg/dia x 90 dias

• Os animais foram monitorados diariamente (2 x / dia) visando observar-se eventuais alterações comportamentais e óbitos .

 

• O peso corporal (BW) foi obtido para cada animal, antes da randomização, e a seguir anotado diariamente durante a duração do experimento.

 

• O peso individual de cada animal foi utilizado também para ajustar a dose diária de P-MAPA.

 

• Consumo de alimentos e água foi avaliado diariamente, bem como o nível de excretas (fezes e urina).

 

•Amostras de sangue e urina foram coletadas e analisadas para se obter avaliações bioquímicas e hematológicas dos animais submetidos à aplicação do composto.

 

• Amostras de sangue foram analisadas por métodos laboratoriais automatizados para se obter a contagem das populações celulares, hemoglobina e hematócrito. 

 

• Contagem diferencial de células da série branca foi realizada nas amostras sanguíneas.

 

• O tempo de coagulação também foi determinado.

 

• Os animais foram necropsiados no final do experimento e todas as peças foram objeto de análises macroscópicas em todas as superfícies externas, orifícios, superfícies externas dos órgãos e ainda as cavidades pélvica, torácica, pélvica e cranial.

 

• O peso dos rins (incluindo adrenais), fígado, coração, baço, timo, cérebro e órgãos reprodutivos foram obtidos e relacionados em relação ao peso corporal para cada animal, ao final do experimento.

 

• Os seguintes tecidos foram preservados em formalina a 10% (tamponada), para finalidades de exames anatomopatológicos:

 

• coração, pulmões, traquéia, fígado, baço, rins, adrenais, bexiga, glândulas salivares, timo, pituitária, gônadas, tireóide, paratireóide, cérebro, olhos, próstata, vesículas seminais, epidídimo, útero, esôfago, estomago, duodeno, jejuno, íleo, linfonodos, ceco, reto, cólon, pâncreas, externo, fêmur, dentes, língua e peças de tecido cutâneo nos locais de aplicação do composto.

 

• Subseqüentemente esses tecidos foram fixados, seccionados e lâminas contendo estes tecidos foram coradas com fixadores e colorações especificas. (hematoxilina e eosina - HE) e outros e submetidas a exames anatomopatológicos, para detecção de eventuais alterações teciduais.

 

• A escala para eventuais lesões foi estabelecida em um intervalo de 1 a 4 ( mínima, leve, moderada, acentuada). Os dados foram coletados para animais individualizados e análises estatísticas foram sumarizadas por grupos.

 

Resultados

 

Peso corporal e peso de órgãos

 

As observações diárias e finais referentes ao peso dos animais, ganho ou perda de peso e peso final dos órgãos foram obtidas, tabuladas e analisadas.

 

As análises referentes ao ganho de peso corporal dos animais ao longo do tempo de experimentação produziram gráficos expressando valores percentuais (curvas de crescimento) não equivalentes e diferentes entre os grupos.

 

A aplicação de P-MAPA afetou a taxa de ganho de peso corporal em ambos os sexos.

 

As fêmeas (veja Figura 2) ganharam mais peso que os controles e testemunhas, em todos os grupos submetidos ao composto

 

Figura 2

 

Em contraste, os machos (veja Figura 3) tiveram aumento de peso corporal em todos os grupos, com exceção do grupo de dose alta (DA) que ganhou menos peso em relação aos controles e animais testemunhas.

 

Figura 3

 

Portanto observou-se em relação ao parâmetro mencionado (ganho de peso corporal) que existe um efeito dose-dependente da aplicação do P-MAPA nos animais de ambos os sexos, embora tal efeito no parâmetro não possa ser interpretado como indicativo de sinais de toxicidade do composto.

 

O peso final dos animais, bem como a relação ou razões de peso/órgãos/peso corporal computados na ocasião das necropsias mostraram diferenças estatisticamente significantes em relação ao peso corporal inicial entre os vários grupos de machos (veja Figura 4) e grupos de fêmeas (veja Figura 5).

 

Figura 4

 

 

Figura 5

Os pesos relativos (peso/100 gramas peso corporal) do timo e baço das fêmeas (veja Figura 5) e machos ( veja Figura 4) mostraram-se aumentados de maneira dose-dependente, assim como o peso relativo dos órgãos reprodutivos dos machos.

 

Entretanto, esse aumento de peso relativo citado, de animais machos e fêmeas, não se mostrou estatisticamente significante.

 

Os pesos relativos de útero/ovário e próstata /vesícula seminal mostraram-se aumentados, mas esse efeito não se mostrou dose dependente da quantidade de P-MAPA administrada.

 

Consumo de alimentos, água e excretas

 

Nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada em relação a esses parâmetros para todos os grupos tratados em relação aos controles.

 

Tabelas e gráficos (alimentos, água e excretas).

 

• Excreção - machos (veja Figura 6)

 

• Consumo médio de alimentos - machos (veja Figura 7)

 

• Consumo médio de água - machos (veja Figura 8)

 

• Excreção - fêmeas (veja Figura 9)

 

• Consumo médio de alimentos - fêmeas (veja Figura 10)

 

• Consumo médio de água - fêmeas (veja Figura 11)

 

Parâmetros hematológicos

 

A análise dos parâmetros hematológicos revelou que os machos (veja Figura 12) e fêmeas ( veja Figura 15) tratados com P-MAPA tiveram um aumento dose-dependente nas contagens de células brancas do sangue

Figura 12

Figura 15

 

A contagem diferencial mostrou que este aumento desta população celular se deu à custa do aumento de linfócitos, neutrófilos e eosinófilos.

 

Não se observaram mudanças na série vermelha e ainda nos valores de hematócrito e hemoglobina, exceto em alguns animais de DA ( machos e fêmeas) - ( veja Figura 12 e Figura 15 acima)

 

O tempo de coagulação se mostrou alterado apenas no grupo tratado com Dose Alta (DA) de P-MAPA. (veja Figura 12 e Figura 15 acima)

 

 Parâmetros Bioquímicos

 

As analises bioquímicas mostraram diferenças estatisticamente significantes, a seguir descritas:

 

Um decréscimo dose-dependente foi observado no nível plasmático das proteínas totais, mas apenas nos grupos de fêmeas, tal decréscimo foi estatisticamente significante.

 

Os níveis de globulina aumentaram, enquanto os níveis de albumina sofreram decréscimo, um decréscimo na relação A/G.

 

Os níveis plasmáticos de Cálcio sofreram decréscimo, enquanto os níveis de Fósforo inorgânico aumentaram, indicando possíveis alterações no metabolismo ósseo, o que, no entanto não foram confirmadas pelas análises anatomopatológicas dos tecidos dentais e do fêmur dos animais.

 

Algumas alterações nos níveis de TGO, TGP, Gama-GT e Bilirrubinas foram observadas, mas não foram observadas alterações dose-dependente, notando-se ainda que o fígado dos animais tratados não mostraram lesões significativas, nos exames anatomopatlógicos .

 

Níveis de colesterol e triglicérides, uréia nitrogenada e creatinina não se mostraram alterados, indicando ausência de atuação do composto no metabolismo renal e lipídico.

 

O decréscimo de glicose observado não pode ser atribuído ao efeito do P-MAPA, uma vez que o tempo de análise pós-coleta para esse parâmetro foi de 10 horas, ocasionando consumo de substrato.

 

Tabelas e gráficos (Hematologia e Bioquímica)

 

• Hematologia ( machos) - veja Figura 12

 

• Análises bioquímicas do soro 1 (machos) - veja Figura 13

 

• Análises bioquímicas do soro 2 (machos) - veja Figura 14

 

• Hematologia (fêmeas) - veja Figura 15

 

• Análises bioquímicas do soro 1 (fêmeas) - veja Figura 16

 

• Análises bioquímicas do soro 2 (fêmeas) - veja Figura 17

 

 

Análises anatomopatológicas

 

Avaliações microscópicas comparativas dos tecidos retirados dos animais controles e tratados foram efetuadas.

 

A avaliação histológica de tecidos pertencentes a todas as estruturas dos animais tratados mostrou resultadas normais (sem alterações consideradas indicativas de patologias) ou ainda reveladoras de danos estruturais e funcionais significativos que pudessem ser associados à utilização do P-MAPA nas dosagens e períodos considerados.

 

As alterações histológicas mais significativas observadas não são indicadoras de toxicidade associada à utilização do produto, mas podem ser relacionadas ao possível mecanismo de ação do P-MAPA e são as seguintes:

 

• Análises do intestino grosso não revelaram alterações de natureza patológica, mas revelaram um marcado aumento de atividade do tecido linfóide intestinal.

 

• As placas de Peyer não mostraram alterações em DB e DM, mas mostraram estruturas muito proeminentes em DA.

 

• As observações histopatológicas dos linfonodos não revelaram anormalidades em relação aos controles. Entretanto, a análise mostrou um aumento da funcionalidade uma vez que as zonas corticais e paracorticais mostraram uma densa população celular, com predominância de células reticulares e linfócitos B.

 

Os cordões e sinus medulares dos linfonodos estavam mais proeminentes nos animais tratados com P-MAPA do que as estruturas similares dos animais controle e testemunhas.

 

• O tecido do timo dos animais tratados com o composto não se mostrou alterado em relação aos controles não tratados, apesar de ter sido observado aumento do peso do órgão nos animais tratados com o P-MAPA. 

 

•  A observação histopatológica do tecido do baço dos animais de baixa (DB) e dose média (DM) mostrou-se dentro da normalidade em relação aos animais controle e testemunha.

 

• Entretanto células linfóides (B e T) são visualizadas em altas concentrações ao redor da artéria penicillata e dos centros germinativos.

 

Existem evidências da presença de numerosos sistemas de células retículo-endoteliais (macrofilos), quando comparado aos animais controles.

 

• Em animais de Dose Alta (DA) uma hiperfunção dos sistemas fagocítico e macrofágico do baço foi observada associada a necrose de elementos linfóides e numerosa presença de megacariócitos.

 

• Essas observações provenientes da análise dos dados dos exames anatomopatológicos dos animais utilizados no experimento são proporcionais às dosagens do imunomodulador P-MAPA utilizadas e podem ser claramente atribuídas à ativação do sistema imunológico, provocadas pela utilização do imunomodulador.

 

 Conclusão dos estudos de toxicidade subcrônica

 

• Comparando-se os parâmetros fisiológicos, as análises bioquímicas e os resultados dos exames anatomopatológicos, concluiu-se que o imunomodulador P-MAPA não apresenta toxicidade relevante, mesmo em altas dosagens no modelo experimental utilizado.

 

As alterações bioquímicas e nos órgãos, principalmente nos animais de dose média e dose alta, foram julgadas de natureza transitória e em sua maioria, estão ligadas a ativação do sistema imunológico causada pelo uso do produto e não sendo representativas de sinais de toxicidade.